目前關(guān)于CRISPR–Cas9技術(shù)的談?wù)撘呀?jīng)演變到了利用該技術(shù)來進(jìn)行人類胚胎的編輯，但研究者表示，真正的技術(shù)革新才剛剛開始;CRISPR可以為我們帶來什么?為什么科學(xué)家們這么熱衷于該技術(shù)?因?yàn)槠淇梢园邢蜃饔萌魏位蚪M的特殊DNA序列，而對(duì)DNA進(jìn)行編輯僅僅是其眾多作用中的一種而已;來自波士頓兒童醫(yī)院的血液病學(xué)家DanielBauer表示，對(duì)于眾多分子生物學(xué)家而言，這種方法可以大大幫助我們來理解基因組的工作模式，CRISPR–Cas9技術(shù)可以真正幫助我們了解我們所想要知道的。

　　本文中，Nature雜志分析了5種方法，即CRISPR–Cas9技術(shù)如何幫助生物學(xué)家們來對(duì)細(xì)胞進(jìn)行編輯修飾。

　　CRISPR–Cas9系統(tǒng)中有兩種主要的成分：Cas9酶，其像分子剪刀一樣沿著DNA進(jìn)行修剪;另一個(gè)是小RNA分子，其可以指導(dǎo)修剪剪刀進(jìn)入DNA的特殊序列來制造切口，細(xì)胞的原始DNA修復(fù)系統(tǒng)就會(huì)廣泛修補(bǔ)這些缺口，但通常會(huì)產(chǎn)生一定的錯(cuò)誤。2012年研究者們揭示了這些基因編輯工具如何切割人類的DNA，而其中一個(gè)小組決定采用另外一種不同的方法，而首先研究者要做的就是破碎基因剪刀。

　　來自加利福尼亞大學(xué)的研究人員JonathanWeissman表示，我們從斯坦福大學(xué)的研究者StanleyQi那里學(xué)到了如何去破碎基因剪刀，研究者StanleyQi對(duì)Cas9酶進(jìn)行了突變以便其可以在同導(dǎo)向RNA匹配的位點(diǎn)同DNA進(jìn)行結(jié)合，同時(shí)不對(duì)DNA進(jìn)行切割，隨后Cas9酶就會(huì)停頓并且阻斷其它蛋白的翻譯，這種攻擊系統(tǒng)就可以幫助研究者實(shí)現(xiàn)對(duì)特殊基因的關(guān)閉，同時(shí)并不改變DNA序列的結(jié)構(gòu)。

　　隨后研究人員拿走了死亡的Cas9酶，并且嘗試了一些新的事情，即將Cas9酶同另外一種可以激活基因表達(dá)的蛋白進(jìn)行結(jié)合，在進(jìn)行了一些巧妙的調(diào)整后，研究者構(gòu)建出了新型的開關(guān)基因的方法。目前很多實(shí)驗(yàn)室都發(fā)表了對(duì)該方法進(jìn)行修改的相關(guān)結(jié)果，而且很多研究者都競(jìng)相利用該方法加速研究進(jìn)展，其中一種最流行的應(yīng)用就是快速產(chǎn)生成百上千個(gè)不同的細(xì)胞系，每一種細(xì)胞系中都包含可以靶向作用特殊基因的不同引導(dǎo)RNA。

　　來自加州大學(xué)舊金山分校的研究者M(jìn)artinKampmann希望對(duì)每一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行篩查來研究是否特殊基因的開啟或關(guān)閉會(huì)影響暴露于蛋白質(zhì)聚集體中的神經(jīng)元的生存情況，蛋白質(zhì)的聚集被認(rèn)為是很多神經(jīng)變性疾病發(fā)病的根源，比如阿爾茲海默氏癥;同時(shí)研究者Kampmann利用RNA干擾進(jìn)行了一項(xiàng)類似的篩選研究，但結(jié)果顯示該技術(shù)存在一定缺點(diǎn);RNAi技術(shù)存在一定的脫靶效應(yīng)。隨后Weissman和其同事對(duì)該方法進(jìn)行了一定調(diào)整以便其依賴于長(zhǎng)鏈引導(dǎo)RNA來發(fā)揮作用，這種RNA攜帶有可以結(jié)合不同蛋白質(zhì)的基序，而這一調(diào)整就可以幫助科學(xué)家們?cè)谕粋€(gè)實(shí)驗(yàn)中的三個(gè)不同位點(diǎn)來激活或抑制基因的表達(dá);研究者認(rèn)為該系統(tǒng)可以幫助一次進(jìn)行5個(gè)實(shí)驗(yàn)，而唯一的限制就是這么多引導(dǎo)RNAs和蛋白質(zhì)如何被填入細(xì)胞中。

　　當(dāng)遺傳學(xué)家MarianneRots開始他的職業(yè)生涯時(shí)，她就想去開發(fā)新的醫(yī)學(xué)療法，于是她學(xué)習(xí)了基因療法，即可以靶向作用疾病中突變的基因，但數(shù)年后她決定更換自己的專業(yè)，Rots說道，我意識(shí)到很多疾病都是因?yàn)榛虮磉_(dá)特性的改變而致，但我從來都沒有這么關(guān)注過其中一種基因突變，而最好的方法就是控制基因的活性，于是我將研究重點(diǎn)從基因組轉(zhuǎn)移到了表觀基因組上來。

　　表觀基因組是添加到DNA及DNA包裹蛋白(組蛋白)上的眾多化合物的“星座”集合，這些化合物可以控制對(duì)DNA的“訪問”，從而適時(shí)地調(diào)節(jié)基因表達(dá)所需的蛋白，而且這些表觀標(biāo)志物可以隨著時(shí)間而改變，其可以隨著有機(jī)體發(fā)育或環(huán)境改變而被添加或者移除。過去很多年里，科學(xué)界花費(fèi)了很多資金來對(duì)不同人類細(xì)胞的表觀遺傳標(biāo)志物進(jìn)行分類編目，但除了可以改變特殊位點(diǎn)上標(biāo)志的能力外，科學(xué)家們并不能確定是否他們可以引發(fā)特定的生物學(xué)改變，CRISPR–Cas9技術(shù)似乎可以扭轉(zhuǎn)這個(gè)局面，2015年4月，杜克大學(xué)的研究者CharlesGersbach開發(fā)了一種系統(tǒng)，其可以利用破碎的分子剪刀將酶類攜帶到基因組中的特殊位點(diǎn)上，以此來將特殊的表觀遺傳標(biāo)志—乙?；砑拥浇M蛋白上。

　　研究小組發(fā)現(xiàn)，將乙?；砑拥胶虳NA相關(guān)的組蛋白上足以使得目標(biāo)基因的表達(dá)飆升，當(dāng)這一成果發(fā)表后，研究者Gersbach將他們所使用的酶“存放”到了Addgene公司以便其他研究者也可以利用其進(jìn)行相關(guān)研究。Gersbach預(yù)測(cè)，當(dāng)多個(gè)表觀遺傳標(biāo)記物被同時(shí)進(jìn)行操控的話或許就會(huì)使得多篇研究論文表現(xiàn)出一股協(xié)同效應(yīng)。

　　Gersbach提供的工具需要被“精煉”，而很多種酶類就可以產(chǎn)生或剔除DNA上的遺傳標(biāo)志物。研究者Rots利用鋅指蛋白探究了癌癥相關(guān)基因上表觀遺傳標(biāo)記物的新功能，如今科學(xué)家們采用CRISPR–Cas9來進(jìn)行相關(guān)工作，新型工具的使用將會(huì)帶來更廣泛的效應(yīng);人們可能會(huì)說這種關(guān)聯(lián)是偶然性的，但Rots卻說道，如果對(duì)表觀遺傳學(xué)進(jìn)行重寫或許并不會(huì)對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生任何影響，但如今我們卻可以很輕松對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，而且有很多人都相繼加入了進(jìn)來。

　　DNA上的表觀遺傳標(biāo)志物并不僅僅是被破碎的遺傳代碼，超過98%的人類基因組都不會(huì)編碼蛋白，但研究者卻認(rèn)為，這些大量的看似垃圾的DNA實(shí)際上也發(fā)揮著重要作用，而且目前研究者正在利用CRISPR–Cas9技術(shù)來研究這些垃圾DNA的奧秘。其中有些基因組編輯RNA分子，比如microRNAs和長(zhǎng)鏈非編碼RNAs，除了制造蛋白以外，這些RNA分子被認(rèn)為還存在其它功能，而其它的序列就是可以放大基因表達(dá)的增強(qiáng)子。很多DNA序列都和常見疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)直接相關(guān)，這取決于包含非編碼RNA和增強(qiáng)子的特殊基因組區(qū)域，在CRISPR–Cas9技術(shù)出現(xiàn)之前，研究者很難確定到底是哪些基因組的問題，但如今卻很方便。

　　如今研究者Farnham和其同事利用CRISPR–Cas9技術(shù)剔除了在前列腺癌癌和結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的突變的增強(qiáng)子區(qū)域，在這項(xiàng)成果未發(fā)表的研究中，研究人員剔除了被認(rèn)為非常關(guān)鍵的增強(qiáng)子;來自MIT的研究者DavidGifford和布萊根婦女醫(yī)院的研究者RichardSherwood就通過合作，利用CRISPR–Cas9技術(shù)在4萬個(gè)字母的序列中引發(fā)突變，隨后他們檢測(cè)了是否每一個(gè)突變都會(huì)對(duì)附近產(chǎn)生熒光蛋白的基因帶來影響，研究者將結(jié)果繪制成了一張展示增強(qiáng)基因表達(dá)的DNA序列圖譜。

　　深入研究“暗物質(zhì)”存在一定挑戰(zhàn)，而CRISPR–Cas9技術(shù)也是一樣，Cas9酶可以切割導(dǎo)向RNA的特殊位點(diǎn)，但僅僅是當(dāng)一種特殊但卻常見的DNA序列出現(xiàn)在切割位點(diǎn)附近時(shí)才會(huì)這樣;如今研究人員正在搜集細(xì)菌王國(guó)中Cas9酶的“親戚”，Cas9酶可以識(shí)別不同的序列;去年來自MIT博德研究所的研究者FengZhang就發(fā)現(xiàn)了一種名為Cpf1的酶類家族，該酶類和Cas9酶相似，這就可以擴(kuò)展這種特殊酶類識(shí)別序列的選擇;但研究者指出，目前并沒有可以替代Cas9酶的新型酶類，未來他們希望可以完整地搜集可以在基因組任意位點(diǎn)被靶向作用的酶類。

　　研究者Gersbach的實(shí)驗(yàn)室利用基因編輯工具來幫助理解細(xì)胞命運(yùn)的變化，同時(shí)研究者還揭示了如何改變細(xì)胞的命運(yùn)，他們希望有一天可以在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)組織供藥物篩選和細(xì)胞療法的開發(fā);但CRISPR–Cas9技術(shù)的效應(yīng)卻是持久性的，而且研究者需要在組織中的特殊位點(diǎn)短暫地開啟或關(guān)閉基因的表達(dá)。

　　Gersbach及其同事就利用這種破碎可修飾的酶類Cas9(激活基因的表達(dá))及被藍(lán)光激活的添加蛋白進(jìn)行研究，這種新型系統(tǒng)就就可以在細(xì)胞暴露光下的時(shí)候誘發(fā)基因的表達(dá)，當(dāng)無光的時(shí)候就會(huì)阻斷基因的表達(dá);來自東京大學(xué)的研究者M(jìn)oritoshiSato開發(fā)了一種相似的系統(tǒng)，并且也制造出了一種可以在藍(lán)光刺激下對(duì)基因組進(jìn)行編輯的Cas9酶。

　　癌癥研究者WenXue在其博士后第一年就開始研究制造可以在某些人類肝癌中產(chǎn)生一種突變的轉(zhuǎn)基因小鼠，他埋頭苦干最終開發(fā)出了對(duì)基因靶向作用非常必要的工具，隨后將該工具注入到胚胎干細(xì)胞中，并且設(shè)法制造攜帶突變的小鼠，這項(xiàng)研究的花費(fèi)是一年，外加2萬美金。一年之后當(dāng)他開始著手另外一種轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)時(shí)，他的導(dǎo)師讓他試試?yán)肅RISPR–Cas9技術(shù)，這次Xue僅僅利用工具對(duì)單細(xì)胞小鼠胚胎進(jìn)行研究，最后僅僅在一個(gè)月內(nèi)就獲得了想要的小鼠種類，最后WenXue的博士后生涯縮短了很長(zhǎng)時(shí)間。

　　如今不管是研究癌癥還是研究神經(jīng)變性疾病的研究者都開始著手利用CRISPR–Cas9來制造用于疾病研究的動(dòng)物模型，該技術(shù)可以幫助科學(xué)家以多種復(fù)雜的方式制造出多種模式動(dòng)物，而研究者Xue就是其一種一位，他利用該技術(shù)在培養(yǎng)基和動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞中對(duì)疾病突變模型進(jìn)行了研究。研究者希望混合并且配對(duì)新型的CRISPR–Cas9技術(shù)來更加精準(zhǔn)地操控動(dòng)物模型的基因組及表觀基因組，這將可以幫助研究人員更加深入地理解常見人類疾病的復(fù)雜性及發(fā)病機(jī)制。

　　就拿腫瘤來講，其擁有許多可以促進(jìn)癌癥發(fā)生的突變，研究者Dow說道，然而他們對(duì)于制造腫瘤去并不是最重要的，但很明確的是我們需要兩個(gè)或三個(gè)、甚至四個(gè)突變來真正地模擬惡性疾病，并且更加深入地模擬人類癌癥;將所有這些突變以老式的方法引入小鼠中或許花費(fèi)非常昂貴而且耗時(shí)。

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　　研究人員PatrickHsu2015年在索爾克研究所開始自己的研究工作，他的目的就是利用基因編輯技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)液或絨猴中模擬神經(jīng)變性疾病的相關(guān)情況，比如阿爾茲海默氏癥和帕金森疾病等，相比小鼠模型而言這種方式可以更加精確地反應(yīng)人類疾病的進(jìn)展，但這在CRISPR–Cas9技術(shù)出現(xiàn)之前卻是非常昂貴而且緩慢的。

　　正巧當(dāng)研究者PatrickHsu設(shè)計(jì)出了新型的實(shí)驗(yàn)方法來遺傳性地對(duì)其首個(gè)CRISPR–Cas9絨猴進(jìn)行工程化操作，他表示，這種方法或許是通往下一步研究的奠基石，很多技術(shù)轉(zhuǎn)瞬即逝，而我們總是應(yīng)該需要考慮需要解決的生物本源問題。未來新型CRISPR基因編輯技術(shù)的發(fā)展或?qū)⒋蠓殴獠省?/p>