CRISPR/Cas9成功與否的關(guān)鍵在于gRNA的設(shè)計(jì)，gRNA和非目標(biāo)區(qū)域過(guò)多的非特異性結(jié)果，脫靶效率較高，特別是靠近PAM的8-10bp不能和非目的區(qū)有高同源性。目前為了提高基因組編輯的準(zhǔn)確性，對(duì)Cas9核酸酶進(jìn)行了突變，突變后的Cas9只能切割DNA雙鏈中的一條鏈，通過(guò)兩個(gè)gRNA引導(dǎo)Cas9對(duì)DNA切割，可以顯著提高基因組編輯的特異性，降低脫靶效應(yīng)。

　　CRISPR/Cas9主要由兩部分組成：gRNA和Cas9蛋白。gRNA由CRISPR RNA（crRNA）與反式激活crRNA（trans-activating crRNA,tracrRNA）組成，crRNA的一部分序列能與tracrRNA配對(duì)，形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)；一部分序列與靶目標(biāo)互補(bǔ)區(qū)域，以此識(shí)別靶序列。Cas9蛋白先與gRNA形成復(fù)合體（Cas9-sgRNA），使Cas9蛋白構(gòu)象變化，產(chǎn)生一條通道，使其更容易與DNA結(jié)合。該復(fù)合體隨機(jī)碰撞DNA，若未識(shí)別到PAM序列，則會(huì)快速離開(kāi)DNA，發(fā)生下一次碰撞；若識(shí)別PAM序列，Cas9蛋白的Arg1333和Arg1335會(huì)與二核苷酸鳥(niǎo)嘌呤結(jié)合，此時(shí)，Ser1109和Lsy1107形成磷酸鎖結(jié)構(gòu)，與PAM序列旁的+1位核苷酸發(fā)生相互作用，促使雙鏈DNA解旋，利用RNA-DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，核對(duì)序列與crRNA的互補(bǔ)情況，若在種子序列出現(xiàn)較多錯(cuò)配，則序列識(shí)別過(guò)程終止，從而確保Cas9在正確的目標(biāo)處發(fā)揮作用。

　　從原理上來(lái)說(shuō)，CRISPR分子診斷方法實(shí)際上是將擴(kuò)增方法與Cas蛋白的檢測(cè)相結(jié)合。CRISPR檢測(cè)在提高靈敏度的同時(shí)，也提高了特異性，而且降低了對(duì)儀器依賴。另外，經(jīng)過(guò)方法優(yōu)化，CRISPR檢測(cè)也做到了多靶標(biāo)、一步法定量檢測(cè)、DNA和RNA相同步驟檢測(cè)和適合野外偏遠(yuǎn)地區(qū)的快速分子檢測(cè)。

　　CRISPR技術(shù)是在20世紀(jì)90年代初發(fā)現(xiàn)的，并在7年后首次用于生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)，迅速成為人類生物學(xué)、農(nóng)業(yè)和微生物學(xué)等領(lǐng)域最流行的基因編輯工具。

　　kaiyun平臺(tái)官網(wǎng)登錄 開(kāi)云網(wǎng)站

　　在2015年初，中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院周文華團(tuán)隊(duì)提出：CRISPR體系在分子診斷領(lǐng)域?qū)⒂芯薮蟮膽?yīng)用前景和優(yōu)勢(shì)，其因此也作為世界范圍內(nèi)最早提出這一設(shè)想的課題組之一。

　　但CRISPR體外診斷技術(shù)的發(fā)展不得不追溯到加州大學(xué)（伯克利）的Jennifer Doudna博士、麻省理工張鋒博士，二者不但在CRISPR診斷技術(shù)的發(fā)明、應(yīng)用上做出奠基性的貢獻(xiàn)，還積極致力于該技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化和商業(yè)化。

　　2016年8月張鋒團(tuán)隊(duì)在Science期刊上發(fā)表了的一篇關(guān)于一種新CRISPR核酸酶的文章C2C2（即俗稱的Cas13a）。他們意外發(fā)現(xiàn)Cas13a在完成特異性切割RNA之后，能夠非特異性的切割任意的單鏈RNA，Cas13a具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性。

　　就在張鋒進(jìn)行Cas13a的研究的同時(shí)，UC-Berkeley大學(xué)的Doudna團(tuán)隊(duì)也在進(jìn)行相同的研究。于同年10在月Nature上發(fā)表研究結(jié)果——Cas13a非特異性切割RNA能夠用于核酸的分子檢測(cè)。

　　此后，張鋒團(tuán)隊(duì)加速了Cas13a在核酸檢測(cè)上的研究，于2017年4月在Science期刊上發(fā)表研究成果——一個(gè)基于CRISPR/Cas13a的分子診斷技術(shù)（簡(jiǎn)稱SHERLOCK）。

　　2018年2月，Doudna團(tuán)隊(duì)在Science期刊上發(fā)表研究成果——除Cas13a具有非特異性切割RNA的功能，Cas12a與Cas13a具有相似的特性，在特異性的切割目的DNA之后，能夠非特異性的切割單鏈DNA。并基于此發(fā)明了基于Cas12a的分子診斷技術(shù)（簡(jiǎn)稱DETECTR）。原理同Cas13a一樣，不過(guò)用于發(fā)光的底物是單鏈DNA。

　　2018年4月，中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院王金團(tuán)隊(duì)在Cell Discovery期刊上發(fā)表了基于Cas12a的分子診斷技術(shù)。

　　2018年9月，中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院周文華團(tuán)隊(duì)在Nature Communications期刊上發(fā)表了研究成果——利用CRISPR系統(tǒng)效應(yīng)蛋白Cas9在與靶核酸分子結(jié)合過(guò)程中獨(dú)特的構(gòu)象變化，高效啟動(dòng)針對(duì)靶核酸分子指數(shù)倍擴(kuò)增的分子診斷技術(shù)（簡(jiǎn)稱CRISDA）。

　　同其它基因編輯技術(shù)相比，CRISPR有很多優(yōu)勢(shì)：靈活性（對(duì)不同的基因靶點(diǎn)只需改變gRNA序列）、高特異性、便捷性、可模塊化、可編程、低成本等等，因此該技術(shù)正在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)和工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域被廣泛開(kāi)發(fā)。在醫(yī)療領(lǐng)域中，CRISPR技術(shù)的應(yīng)用也主要有三個(gè)方向：治療、科研工具、體外診斷（IVD）。

　　就CRISPR技術(shù)在IVD領(lǐng)域來(lái)看：CRISPR診斷特異性極好，可以檢測(cè)到一個(gè)堿基的突變，非常適合早期篩查腫瘤、檢測(cè)腫瘤易感基因和致病基因；

　　同時(shí)，CRISPR診斷技術(shù)操作簡(jiǎn)單、對(duì)儀器設(shè)備依賴性低、價(jià)格低廉，適合野外檢測(cè)和不發(fā)達(dá)地區(qū)檢測(cè)；例如國(guó)內(nèi)某獸醫(yī)科研單位基于CRISPR建立適合養(yǎng)殖場(chǎng)凈化的診斷方法，剛果民主共和國(guó)利用CRISPR分子診斷技術(shù)檢測(cè)埃博拉病毒（Ebola virus）；

　　另外，CRISPR診斷對(duì)操作者的要求低、結(jié)果可視化，因此家庭用CRISPR診斷試劑盒也是許多公司發(fā)展的方向。

　　據(jù)美國(guó)咨詢公司MarketsandMarkets發(fā)布的CRISPR技術(shù)市場(chǎng)分析，目前，CRISPR技術(shù)主要應(yīng)用在科研、農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)等方面；其中，生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用將成為未來(lái)五年內(nèi)增長(zhǎng)最快的部分，而基因治療、藥物發(fā)現(xiàn)和診斷方面的發(fā)展將推動(dòng)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的增長(zhǎng)。2017-2023年期間CRISPR技術(shù)的市場(chǎng)規(guī)模在2017年為5.46億美元，到2023年將增長(zhǎng)至39億美元，其復(fù)合年增長(zhǎng)率（CAGR）將達(dá)44%；CRISPR體外診斷市場(chǎng)規(guī)模預(yù)計(jì)自2020年開(kāi)始將呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)。

　　從產(chǎn)品和服務(wù)來(lái)看，CRISPR技術(shù)市場(chǎng)目前以產(chǎn)品為主，相關(guān)的酶將占據(jù)產(chǎn)品市場(chǎng)的最大份額，這是CRISPR過(guò)程中的關(guān)鍵成分之一。

　　目前我國(guó)進(jìn)行CRISPR研發(fā)的公司主要集中在南京、北京和上海地區(qū)，形成了以江浙滬為核心的研發(fā)地帶。知名公司包括金斯瑞、德泰生物、賽貝生物等21家左右；國(guó)內(nèi)致力于CRISPR技術(shù)診斷應(yīng)用的機(jī)構(gòu)主要有微遠(yuǎn)基因、克睿基因等。

　　作為潛在的醫(yī)療手段，它的精確度仍然不夠。一旦基因編輯的流程啟動(dòng)，而目前還沒(méi)有方法可以終止基因編輯的過(guò)程，因而就只能等待整個(gè)過(guò)程自然結(jié)束。目前該技術(shù)中Cas9酶是“切割”酶中最受關(guān)注的，Cas酶切割DNA雙螺旋的兩條鏈。但研究表明，CRISPR/Cas9 可以擊中準(zhǔn)確目標(biāo)的基因編輯中，有大約一半發(fā)生在編輯過(guò)程開(kāi)始的6小時(shí)內(nèi)；而在6小時(shí)后，脫靶的編輯開(kāi)始變多，精準(zhǔn)度不斷降低。因此，這種“雙鏈斷裂”引起人們對(duì)切割精準(zhǔn)度的擔(dān)憂，科學(xué)家們正在積極尋找其替代品。

　　在使用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的時(shí)候，個(gè)體化的差異會(huì)導(dǎo)致基因編輯系統(tǒng)失效或者造成損害的情況出現(xiàn)。而由于與gRNA不匹配，一個(gè)堿基對(duì)所產(chǎn)生的基因差異性可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)合效率下降，變異體也可能會(huì)導(dǎo)致在可能造成傷害的新位點(diǎn)上的結(jié)合。因此，必須在臨床前研究以確保在gRNA設(shè)計(jì)階段就考慮到基因變異并為臨床翻譯驗(yàn)證這些gRNA，最終為不同基因型患者提供“安全、有效、個(gè)性化”的個(gè)性化產(chǎn)品。

　　前間區(qū)序列鄰近基序（PAM）是一個(gè)位于靶DNA3’端的短核苷酸基序，可被Cas9蛋白特異性識(shí)別?；撔枣溓蚓勺R(shí)別標(biāo)準(zhǔn)PAM NGG和非標(biāo)準(zhǔn)PAM NAG。理論上，生物基因組中NGG每隔8bp堿基出現(xiàn)一次；NRG則每4bp堿基出現(xiàn)一次。但由于不同基因序列上的差異，并非所有的基因都能有合適的PAM。分析玉米的全基因組，在有注釋的外顯子中僅30%能找到特異性切割位點(diǎn)。這表明，PAM在一定程度上限制了Cas9剪切位點(diǎn)的選擇。為了減弱PAM對(duì)Cas9蛋白的額限制，可對(duì)其進(jìn)行改造和使用Cas9直系同源酶。

　　中外CRISPR診斷技術(shù)公司不相伯仲，基本處于同一起跑線，當(dāng)前世界上還未形成絕對(duì)成熟，以及相關(guān)領(lǐng)域的龍頭企業(yè)，商業(yè)化和產(chǎn)業(yè)化均處于不斷探索之中。

　　公司曾從NFX手中獲得過(guò)12萬(wàn)美元的投資；2018年8月獲得了由Mayfield領(lǐng)投，NFX、8VC、蘋(píng)果CEO蒂姆·庫(kù)克和早期癌癥篩查公司Grail前首席執(zhí)行官Jeff Huber參投的2300萬(wàn)美元A輪融資。

　　公司于2019年張鋒參與成立，核心技術(shù)由麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)授權(quán)，分別是基于基因編輯技術(shù)CRISPR的診斷技術(shù)平臺(tái)SHERLOCK，和基于合成生物學(xué)的分子診斷平臺(tái)INSPECTR。公司基于CRISPR技術(shù)完成快速診斷，可以檢測(cè)多種生物或樣本類型的遺傳基因，直至達(dá)到個(gè)位數(shù)的阿摩爾級(jí)。

　　2019年3月獲得了由 Northpond Ventures 和BV百度風(fēng)投領(lǐng)投3500萬(wàn)美元的風(fēng)險(xiǎn)投資；2019年9月，從DTRA獲得了約200萬(wàn)美元的補(bǔ)助金；2019年11月獲得梅琳達(dá)·蓋茨基金會(huì)單筆數(shù)額不詳?shù)馁Y助金。

　　公司成立于2016年，是一家由CRISPR基因編輯技術(shù)應(yīng)用的先驅(qū)者聯(lián)合創(chuàng)辦的轉(zhuǎn)化型生物科技企業(yè)，專注于新型醫(yī)藥、分子診斷領(lǐng)域中CRISPR技術(shù)原創(chuàng)性應(yīng)用的開(kāi)發(fā)，致力于解決難治愈性腫瘤、復(fù)雜遺傳性疾病的臨床需求。

　　2018年8月完成由啟明創(chuàng)投領(lǐng)投，清松資本、盛鼎投資共同投資的1700萬(wàn)美元A輪融資。

　　公司成立于2018年，專注于基因科技與精準(zhǔn)醫(yī)療方向，擁有兩大核心技術(shù)平臺(tái)，包括基因編輯技術(shù)(CRISPR)的快速診斷平臺(tái)與二代高通量測(cè)序(NGS)平臺(tái)。產(chǎn)品研發(fā)方向?yàn)槟[瘤靶向藥物檢測(cè)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、早期篩查和病原體的精準(zhǔn)鑒定、耐藥基因、毒力因子檢測(cè)產(chǎn)品，其通過(guò)獨(dú)立醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所或醫(yī)院聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室的業(yè)務(wù)模式和平臺(tái)，為大眾提供臨床檢測(cè)服務(wù)。

　　公司成立于2019年，是一家專注基因檢測(cè)，以分子技術(shù)為平臺(tái)的高新技術(shù)企業(yè)，致力于為客戶提供感染性疾病分子診斷的整體解決方案。圍繞基因編輯（CRISPR/Cas）和高通量測(cè)序（NGS）兩大前沿技術(shù)路線，專注打造新一代分子診斷平臺(tái)。

　　2020年3月完成由比鄰星創(chuàng)投、普華資本和體外診斷資深產(chǎn)業(yè)人士等聯(lián)合投資的近億元人民幣Pre-A輪融資。

　　文章僅代表作者本人觀點(diǎn)，與醫(yī)業(yè)觀察立場(chǎng)無(wú)關(guān)。文章圖片均來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系作者刪除。歡迎聯(lián)系小編，微信號(hào) yiliaoguancha@今日話題

　　--

　　5月汽車銷量搶先看，比亞迪集團(tuán)、上汽集團(tuán)、一汽集團(tuán)雄霸前三甲，小鵬、小米汽車未進(jìn)前十

　　近年來(lái)在精細(xì)化育兒理念之下，兒童護(hù)膚品成為了比較熱門(mén)的細(xì)分品類，也迎來(lái)了眾多品牌布局，從網(wǎng)紅直播間到母嬰店貨架，宣稱“天

　　近年來(lái)家長(zhǎng)對(duì)于兒童防曬的意識(shí)顯著增強(qiáng)，并且不再滿足于防曬服飾、防曬帽、防曬傘等物理防曬方式，兒童防曬霜、防曬噴霧等產(chǎn)品成

　　嬰兒水作為一個(gè)細(xì)分品類關(guān)注度在提升，吸引眾多品牌跨界布局，“低鈉淡礦”、“商業(yè)無(wú)菌生產(chǎn)”這種概念包裝密集涌現(xiàn)，推動(dòng)產(chǎn)品價(jià)